1楼：阿斯顿发斯蒂
你好，我现在也正在做分子克隆，与你共勉~
分子克隆
选择目的基因，并设计相应引物；（你现在已经有了）用引物pcr扩增目的基因片段；
选择合适（抗性标记、酶切位点等）的克隆载体（为了保真扩增），并将pcr片段连接入克隆载体中；（一般用taq酶的pcr产物在末尾会自带一个a，可在solution 1作用下与两端各带一个t的线性t载体直接相连）
将连接产物转化入感受态大肠杆菌，使之在含有抗生素的培养基上生长扩增；
从大肠杆菌中提取质粒（即前面的连接产物），酶切鉴定和测序鉴定均无误后将目的基因片段切下并与新的表达载体连接，然后再次转化入大肠杆菌中扩增，再提质粒，即得到想要的目的基因片段克隆。
注意克隆载体和表达载体的区别，克隆载体可大量扩增而不能表达，表达载体可表达成蛋白但复制的数量少，因此先用克隆载体大量扩增，再连入表达载体中用于实验。
相同点式两种载体都是质粒。
基因克隆的步骤是什么？
2楼：匿名用户
不知道大家对基因克隆方面的技术了解多少，经过较长时间的总结和实践，有了一些自己的体会，拿出来与大家分享一下，给大家做一个抛砖引玉的作用吧。
（1）是酶切位点的选择.
我的实验室有三种常用的酶,在设计pcr产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的.因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同,最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶.
（2）pcr引物的设计。
做过实验的战友都清楚,有的时候很多pcr引物的选择是没有选择的,如果实在是没办法的条件下,只能在pcr引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位,我不知道说清楚没有,如果引物序列ok,可以忽略上句话.所以大多数情况下引物我们是没得选择的,那么我们只能从pcr扩增条件上下功夫.
（3）pcr扩增
对于pcr扩增其实不同的基因可能策略不同.首先很多新手会忽略引物的浓度问题,把pcr的实验条件进行了全方位优化,50ul体系中buffer 5ul、mg2+ 1mm、dntp 0.2mm、引物每支1ul（配成10umol/l浓度)、pcr酶一般是0.
5ul、其余部分用水补平,混匀,离心一下,进行pcr扩增.其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/l浓度保存,吸取少量稀释十倍后用于pcr反应,这个浓度是最佳的.所以pcr体系中引物并不是越多越好,同样的模板的量也很关键,一般我都在10ng-100ng之间,太少或太多都会抑制pcr反应.
当然,不同的基因其退火温度差异较大,建议第一次做直接做梯度pcr,设置的温度范围宽些,总会有扩出来的.反正把反应体系加好把温度控制好,如果这样仍然扩不出来,那就直接调整dna模版的量吧,其他的因素应该不是原因（当然得保证引物,以及酶的质量得前提下）.
（4）pcr产物的酶切,我认为pcr产物切得尽可能的充分对克隆很重要,毕竟保护性碱基只有几个.
（5）质粒的酶切.
虽然质粒的酶切很简单但是却很讲究,决定着克隆的成败.质粒提取我一般都用试剂盒,质粒提取完毕后我会用紫外分光光度法对质粒进行定量测定,根据a260的值计算出质粒的量,然后再进行酶切,一般酶切体系60ul,60ul体系中我只切总量1ug的质粒,一次切两管,酶切过夜后切胶**或者不切胶直接**,这取决于两个限制性内切酶之间的距离,十几bp以内我就直接**了,如果偏大就要切胶**.
（6）连接
连接我采用的是promega公司的t4 dna连接酶,它的特点是22度连接三小时以上几款,这样我就可以在上午把质粒片段以及pcr片段**后马上做连接,连接一个白天到下午可以做转化了,涂板,过夜培养第二天早上看结果.然后挑克隆（一般我一个基因就挑四个克隆足已）培养一白天,下午稍晚些提质粒,然后马上酶切鉴定,一般酶切鉴定体系中我都做20ul体系,酶用0.5微升就够了（呵呵,该省的就省点吧）,酶切一个小时跑胶就可以知道克隆是否成功了.
这样从pcr到克隆鉴定完毕,一共三天.
这个是个人在基因克隆
3楼：匿名用户
dna的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的dn**段同能够自我复制的载体dna连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程
4楼：倾月聆寒
首先是目的dn**段的获得，然后将目的片断和载体分子连接，将导入受体细胞，重组子的筛选，
基因克隆的基本步骤有哪些
5楼：阿楼爱吃肉
基因克隆的基本步骤流程如下：
一、目的dn**段的获得：
dna克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群dna分子，这些dna分子或来自于目的生物基因组dna或来自目的细胞mrna逆转录合成的双链 cdna分子。
由于基因组dna较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的dna小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组dna 或cdna中通过pcr技术可以获得目的基因。
二、载体的选择：
基因克隆常用的载体有：质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、单链dna噬菌体载体、噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。
三、体外重组：
体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割dna分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过t4 dna连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。
当目的dn**断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端dna分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端dna分子通过一些修饰；
如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，pcr法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。
四、导入受体细胞：
载体dna分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组dna分子。
五、重组子的筛选：
从不同的重组dna分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：
（1）插入失活法：外源dn**段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。
（2）pcr筛选和限制酶酶切法：提取转化子中的重组dna分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过pcr技术筛选阳性克隆。pcr法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。
（3）核酸分子杂交法：制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。
（4）免疫学筛选法：获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分orf片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。
6楼：抗压吧务队团
步骤如下：
1、目的dn**段的获得
dna克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群dna分子，这些dna分子或来自于目的生物基因组dna或来自目的细胞mrna逆转录合成的双链 cdna分子。
由于基因组dna较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的dna小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。
若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组dna 或cdna中通过pcr技术可以获得目的基因。
2、载体的选择
基因工程的载体应具有一些基本的性质：
（1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的dn**段得以扩增。
（2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源dn**段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。
（3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。
（4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源dn**段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。
dna克隆常用的载体有：质粒载），噬菌体载体，柯斯质粒载体，单链dna噬菌体载体，噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。
3、体外重组
体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割dna分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过t4 dna连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。
当目的dn**断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。
有时为了不同的克隆目的，如将平端dna分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端dna分子通过一些修饰，如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，pcr法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。
4、导入受体细胞
载体dna分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组dna分子。
将外源重组dna分子导入原核宿主细胞的方法有转化，转染，转导。重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中，同样重组噬菌体dna可以通过转染技术导入。
转染效率不高，因此将重组噬菌体 dna或柯斯质粒体外包装成有浸染性的噬菌体颗粒，借助这些噬菌体颗粒将重组dna分子导入到宿主细胞转导技术，这种转导技术的导入效率要比转染的导入效率高。
5、重组子的筛选
从不同的重组dna分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：
（一）插入失活法
外源dn**段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。
（二）pcr筛选和限制酶酶切法
提取转化子中的重组dna分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过pcr技术筛选阳性克隆。pcr法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。
（三）核酸分子杂交法
制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。
（四）免疫学筛选法
获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分orf片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。
上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。
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