1楼:南京金益柏生物科技****
rt-pcr的核心还是pcr,模板是cdna,只不过这个cdna是rna反转录来的~~~ncbi上给的是cdna的序列
普通rt-pcr与实时荧光定量pcr的引物有什么区别?
2楼:常映寒黄彦
区别http://baike.baidu.***/view/630506.htm
如果rt-pcr的扩增产物只有1,200bp,而且足够保守可以定位荧光pcr的目的基因
那就可以通用
3楼:奉俏丽奈鲸
实时定量的引物设计要求比较高,可以按普通引物设计的方法来做,但是设计时要注意扩增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之间.同时要保证这对引物有绝对的特异性,因为要是产生非特异性扩增的话,就不能准确的计量模板量了,这样就失去了实时定量的意义了
4楼:僪文赋板惠
普通rt-pcr是半定量的。。即需要从条带的亮度判断量的相对多少。。
荧光定量pcr是定量的。。
因为两者反应体系,要求有很大区别,引物通常不能通用。除了上面提到的荧光定量pcr产物要控制在60-200nt之间,退火温度也比较高。。一般要达到60度
普通rt-pcr与实时荧光定量pcr的引物有什么区别
5楼:匿名用户
实时定量的引物设计要求比较高,可以按普通引物设计的方法来做,但是设计时要注意扩增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之间.同时要保证这对引物有绝对的特异性,因为要是产生非特异性扩增的话,就不能准确的计量模板量了,这样就失去了实时定量的意义了
做pcr,rtpcr和做克隆基因的引物有何不同
6楼:匿名用户
不同点很多。最简介回答,是目的不同,侧重点也不同:
普通pcr。只考虑能不能扩增出来就行。
rtpcr。上荧光的话,对引物质量要求高,得做个hplc或者page纯化;其次对引物设计要求高,考虑得率,特异性等因素。
克隆引物。考虑加入常见酶切位点,导入何种目的载体,碱基密码子偏好性等。
7楼:涛涛涛
你做的是什么实验呢?引物设计设计范围很广
rt-pcr的引物如何设计?
8楼:匿名用户
引物可以通过一些软件设计,比如primer 5 ,但是还需要注意一些细节问题。
比如1.引物最好在模板cdna的保守区内设计。 dna序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在ncbi上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如dnaman)比对(alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74°C,不适于taq dna 聚合酶进行反应。
3.引物gc含量在40%~60%之间,tm值最好接近72°C。 gc含量(***position)过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的gc含量不能相差太大。另外,上下游引物的tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于tm值5~10°C。
若按公式tm= 4(g+c)+2(a+t)估计引物的tm值,则有效引物的tm为55~80°C,其tm值最好接近72°C以使复性条件最佳。
9楼:匿名用户
先找出你要扩增的“保守序列”的所有碱基,到专门的设计软件上搜索最佳引物序列。
软件和软件的使用在丁香园上均可找到。
http://****dxy.**/bbs不过一开始最好有设计过的人在身边指点,不然会有很多问题
10楼:匿名用户
http://****bbioo.***/bio101/2007/20171.htm
上面有很清楚
的设计方法。
11楼:许无忧
建议你去借分子克隆实验指南来看看,或者采用引物设计软件,比如primer premier 5,把序列输入就可以得到不同打分的引物对
12楼:归跃卜叶丰
microrna的茎环引物可以自己设计。据说有公司也可以帮忙合成,不过还是自己设计好了发过去比较省钱吧。内参一般是u6,因为它长度和microrna一样比较短。
我做的反转录内参是跟microrna分开管子转的real-time
quantification
ofmicrornas
bystem–loop
rt–pcr
这篇文献上有比较容易看懂的茎环引物的图。也可以看看几篇相关的中文文献都有。
rtpcr的引物设计有什么不同吗
13楼:匿名用户
没有严格的要求,只要考虑两方面就行:(1)扩增的特异性;(2)扩增的高效性。所以总体要求引物不能太长,扩增产物不能太长,其他参数综合考虑不能太差。
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