1楼：匿名用户
引物设计有 3 条基本原则：
引物与模板的序列要紧密互补。
引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。
再次引物不能在模板的非目的位点引发dna聚合反应(即错配)。
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条dna模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条dna模板链互补。
在pcr（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用pcr扩增技术，目的基因dna受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在dna聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
pcr引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列。如前述，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保pcr的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发dna聚合反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用 g 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplexformation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的gc 含量（***position），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
做real time时,用于sybr green i法时的一对引物与一般pcr的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
避免重复碱基，尤其是g。
tm=58-60度。
gc=30-80%。
3'端最后5个碱基内不能有多于2个的g或c。
正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
pcr扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
引物的退火温度要高，一般要在60度以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组dna污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组dna污染的影响。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
关于blast的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在genebank中公开的全部物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
设计pcr引物的主要原则是什么？
2楼：泉淑琴永月
pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则分述如下：
1、pcr的技术的主要步骤：
①dna变性：（90℃-96℃）：双链dna模板在热作用下，氢键断裂，形成单链dna
②退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与dna模板结合，形成局部双链。
③延伸：（70℃-75℃）：在taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dntp为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的dna链。
每一循环经过变性、退火和延伸，dna含量即增加一倍。如图所示：现在有些pcr因为扩增区很短，即使taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
2、引物设计的基本原则
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物碱基：g+c含量以40-60%为宜，g+c太少扩增效果不佳，g+c
过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
③引物内部不应出现互补序列。
④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3
′端的互补重叠。
⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是g和c。
⑦引物的5
′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
引物的设计原则
3楼：lee罗亚辉
1、长度：15—30bp，其有效长度[ln=2(g十c)十(a十t)]一般不大于38，否则pcr的最适延伸温度会超过taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。
2、g十c含量：应在40%一60%之间，pcr扩增中的复性温度一般是较低tm值引物的tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其tm恒等于4×(g十c)十2×(a十t)。
3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续g或c，否则会使引物在g十c富集序列区错误引发。
4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。
5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。
7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为g或c。
8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。
扩展资料
引物合成
1、是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团dmt，获得游离的5′-羟基。
2、合成dna的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被dmt保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
4楼：灰原哀
一般使用primer5就挺好，不知道你是扩基因还是启动子，基因是否是已知。
pcr引物设计原理:
pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列。因此，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到dna序列的保守区。同时应**将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看p1引物。一般引物序列中g+c含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则p1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
临床实验室
pcr引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。
④ g+c含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5′端可以修饰。
⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
pcr引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列。如前述，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保pcr的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区dna二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以**估计mrna的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△g°）小于58.
6lkj/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧gtp取代dgtp对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：ln=2（g+c）+（a+t+，ln值不能大于38，因为》38时，最适延伸温度会超过taq dna聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.g+c含量
g+c含量一般为40%~60%。其tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于tm值5~10℃。若按公式tm=4（g+c）+2（a+t）估计引物的tm值，则有效引物的tm为55~80℃，其tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的g或c，因这样会使引物在g+c富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
临床实验室
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的pcr（as-pcr）反应中，引物3′端不能发生错配。
在标准pcr反应体系中，用2u taq dna聚合酶和800μmol/l dntp（四种dntp各200μmol/l）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增hiv-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。a∶a错配使产量下降至1/20，a∶g和c∶c错七下降至1/100。引物a：
模板g与引物g：模板a错配对pcr影响是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着pcr产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：
加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、eu3+等；引入蛋白质结合dna序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
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