1楼：匿名用户
微生物细胞用钙离子处理
感受态细胞的细胞膜通透性变大
在基因工程的导入过程中可作为受体细胞。
感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？
2楼：匿名用户
特点：处于最适摄取和容纳外来dna的生理状态
cacl2法：
操作：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，极易与外源dna相粘附并在细胞表面形成复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，外源dna就可能被细胞吸收。进入细胞的外源dna分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源dna分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
3楼：匿名用户
感受态是指受体细胞最易接受外源dn**段并能实现转化的一种生理状态。它虽受遗传控制，但表现差别很大。时间上：
有的在生长的指数期后期（s.pneumoniae）。出现在指数末期和稳定期（bacillus其中一种）；感受态细胞所占比例和持续时间也不同。
外界环境因子如环腺甘酸及ca对感受态也有影响。
保证质量：查资料。必须要查大量的资料，你做什么菌，就要查相关资料。
做研究生都是从查资料开始的。
关于制备感受态细胞的方法有固定的几种。但并非完全适合。需要在原有的基础上进行摸索。
制备感受态细胞的关键是什么
4楼：anyway丶
制备感受态细胞的关键是将外源dna分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。
主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
扩展资料
制作方法
cacl2法
1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞
细胞膜通透性发生变化，极易与外源dna相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
联合其它的二价金属离子（如mn、co）、dmso或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源dna就可能被细胞吸收。进入细胞的外源dna分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源dna分子的阳性克隆。
电转法电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使dna进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环dna。
5楼：匿名用户
尽量使细胞保持在低温下，可冰浴，这样可降低细胞代谢率，防治细胞的大量死亡。因为无培养基，代谢强，则会引起大量细胞死亡。
6楼：浙大阿米巴
热激的时间和操作速度掌握好
感受态细胞的制备时有什么注意事项
7楼：天寂无痕
1、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 inoue 的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一
个非常理想方法。
2、在保存感受态时，dmso 要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
3、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。
4、冻存的感受态用一次拿一管，不要反复冻融。化冻之后立即使用，不要冰上放太久。
5、操作时可以轻弹轻甩，尽量避免用移液器吹吸。
8楼：y神级第六人
（1）质粒dna的质量和浓度：
用于转化的质粒dna应主要是超螺旋态的，转化率与外源dna的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源dna的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，dna溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。
此外，重组dna分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组dna大都构成环状双螺旋分子。
（2）感受态细胞的质量：
所用的cacl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃
（3）细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的od600控制。对tg1菌株，od600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意od600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。
（二）感受态细胞转化中的影响：
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、dna酶或杂dna所污染，否则均会影响转化效率或杂dna的转入。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
常用感受态细胞制备方法有哪些？
9楼：小灰马
方法一：
细菌转化的方法多以mendel和higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用
冰预冷的cacl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。
用cacl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。
1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌dh52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mllb培养基的1l或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量od600值≈0.4。
2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。
3．于4℃用sorvallgs2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以**细胞。
4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。 5．以10ml用冰预冷的0.1mmcacl2重悬每份沉淀，放于冰上。
6．于4℃用sorvallgs3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以**细胞。
7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1m cacl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。
9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加dna或连接反应混合物（体积≤10μl，dna≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。
10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。
11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。 12．每离心管加800μlsoc培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。 13．将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l mgso4和相应抗生素的sob培养基上。
14．将平板置于室温至液体被吸收。
15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。
方法二：
cassuper one-step ***petent cell preps kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒dna的转化，可满足一般实验的要求。与cacl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于cacl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。
准备工作：
1． 从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在lb平板上划线，37度过夜至长 出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5ml lb培养基中，37℃，250rpm， 过夜培养。
2． 次日从5ml lb培养物吸取200μl转入50ml lb培养基中（250ml 锥形瓶），37 ℃，250rpm培养2小时，此时od600约0.4—0.5。
感受态细胞的制备：
3． 吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。 4． 加入100μl预冷的solution a，悬浮菌体，冰浴30分钟。
5． 此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。 细胞转化：
6． 在感受态细胞中加入100pg-10ngdna，混匀，冰浴30分钟，然后42℃ 1分钟热 击，再次冰浴2 分钟。加入0.9ml lb 培养基，20μl solution b，37℃，振荡 培养1小时。
7． 取适当菌液（100-200μl）涂布相应抗性的平板。 8． 过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。 补充说明：
1． 所用器具一定要清洁；
2． 操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml 锥形 瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；
3． 在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mm的mgcl2 ，效果会更好一些； 4． 为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的od值不要高于0.6； 5． 制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作；
6． 细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜lb，简化操作 步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。
方法三：
1、取1%大肠杆菌e.coli接种于含2ml lb培养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml lb培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至od600=0.
3ml离心管中，冰浴10min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液
5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1m cacl2溶液中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液
7、将菌体悬浮于0.1ml cacl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。
方法四：
（1）将1ml过夜培养的细菌（如dh52、tg1、tm101）接种于100ml2×yt培养于500ml
烧瓶。于37℃刷烈振荡，通常≥200rpm培养的细菌密度约od550=0.2～0.5(5×107
cells/ml),需2～4h。
（2）将培养物放于冰上致冷10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。 （3）弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mmcacl2和10mm tris·hcl（ph8.0）无菌冷冻液体中。
（4）将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。
（5）弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mmcacl和10mmtris·hcl（ph8.0）无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。
200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80℃冰箱中。
方法五：
tsb法（也是本人热衷的方法） 1.药品制备
1m mg2+
(1m mgso4 和 1m mgcl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。 tsb液（30ml/ 80ml菌液）（现配现用）：
peg3350 3g tryptone 0.3g yeast extract 0.15g nacl 0.
3g 2. 步骤： （1）活化菌株
（2）挑单菌落培养于5ml 的液笨培养基中
（3）取液体培养物50ul于80ml的液体培养基中进行扩大培养
（4）370
c培养3－4小时，od600在0.4－0.6 （5）离心，去上清
（6）加入20mltsb，重悬 （7）离心，去上清
（8）加入10mltsb，再加入15－20%的甘油，分装保存 注，整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。
转化程序 （1）取出200μl感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入dna或连接反应混合物，dna量通常≤50mg。用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上40～45min。 （2）将管放于42℃水浴中2min。
（3）然后每管直接加入1.0ml2×yt培养基，倒置混匀，并于37℃培养8～12h，干浴或水浴，不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。
（4）每200μl转化混合物分别于6个2×yt琼脂培养板上补充相应抗生素，并含有x-gal（20mg/ml）、iptg（200mg/ml）。
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