1楼：匿名用户
先连接t载体是为了提高转化效率一般来说市面上**的t载体都进行了优化，容易连接片段（也就是效率较高），因此构建表达载体时有时会先连接t载体。同时t载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。更重要的是，t载体往往设计了蓝白斑筛选的功能，插入片段的载体会呈现白色，这样也容易区分验证，不用每个单菌落都拿去做colonypcr或提质粒酶切验证。
当然也不是绝对的，我们实验室就经常直接把片段酶切后连接表达载体，不经过t载体这一步，其实影响并不大。如果你的情况比较特殊（比如片段较大，或是对应的表达载体拷贝数较低等），可以考虑连接t载体，不然的话不是非常必要。
质粒构建的过程中，如果是想把α基因与a质粒重组，但为什么要先与一个b质粒先重组再构建呢？
2楼：
什么基因？什么质粒？
正常情况不用这样做的
一般做表达用的基因片段是需要测序鉴定的
连t载体就是为了去测序，证实你扩增片段没有突变且是你需要的目的片段然后再去连接你的目的载体就ok了
3楼：月令楼
其实是可以直接连到目的载体的，而且大多数情况下就是这么做的，但是前提是你pcr的产物已经加好相应的酶切位点以及保护碱基，然后测序检测结果就可以了。但是在实际操作过程中，有的时候连目的载体的直接连接并不是那么理想的，所以可以加一步，先和t载体连接，测序结果如果正确，然后再做shuttle，连接到目的载体上，因为t载体很好连，所以有时候在目的载体连不上的时候可以使用t载体。
为什么要先构建克隆载体再用表达载体
4楼：匿名用户
构建克隆载体是大量扩增dn**段，用以测序、酶切和改造等对dna实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。
为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为：
①得到大量的dna，虽然pcr也可以，但pcr扩增有出错率、但你每做一次常规的pcr，而且每次都要重新提dna和rna才行，而且，pcr反应的试剂盒又不便宜，用pcr来制备大量dna有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于pcr），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的dna。
②测序需要。你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。
你要写**必须要给人真凭实据。
5楼：匿名用户
先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增pcr目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。
很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的pcr产物往往是一些各种pcr片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。同时保存的pcr片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。
先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因pcr片段的保存。
6楼：匿名用户
你最早的目的基因、质粒什么的都是拿去公司合成的，很少量，所以要先克隆，把它变多，再做实验，去表达
7楼：匿名用户
这样才能选取合适的克隆载体，提高克隆效率，增大表达量，从而高效的得到所需的表达产物。
重组质粒构建 一个dna为什么要接入两个不同的载体？
8楼：匿名用户
哈哈，我就是做这个的
，因为基因直接克隆出来，酶切得不太好，而且也不容易连到pet上面，而pmd是克隆载体，上面添加了多聚t，pcr的产物末端通常会多p出几个多聚a，a和t互补，再用连接液连接，就非常容易连上，pmd是高拷贝质粒，将会复制出很多质粒，再酶切提出里面的目的片段，连到pet上就相对容易了
9楼：来禄张廖湘云
我。。知。。道
加。。我。。私。。聊
t载体克隆测序没有突变连接表达载体碱基为什么突变了
10楼：o七星和尚
首先看你是做什么用了，做什么用很关键的，你如果想表达蛋白，那么重新克隆吧
或者用点突变试剂盒，不过这个太贵。
建议你克隆基因的时候选用高保真的酶，这样突变概率比较小。也不会比普通酶贵很多。
如果克隆的顺利的话 ，应该很块的，实在是不想重新克隆，那做点突变也很耗时间，耗钱。也可以用突变pcr，选择高保真的酶做pcr扩增然后拼接，不过要注意真正的高保真pcr酶末端是完全没有a的，必须要做一步3‘加a的步骤才能克隆到t载体里，如果哪家忽悠他们的酶是高保真酶还能直接克隆到t载体里那这款酶要么根本就不是高保真酶，要么是高保真酶和taq的混合酶，理解了原理就不会那么容易被忽悠了。又或者多选择几个单克隆去测序。。。。
如果是做敲除，构建重组载体，那大可不必。做了几次构建，都有相同的突变
那大概就是模板突变了
很简单的处理方法，分两段pcr，用引物修正突变位置，最后overlap在一起。
直接把质粒p下来的点突变方法也ok，不需要买试剂盒，多看看相关文献和经验就行
哈，，如有帮助，，万望采纳哦亲
为什么pcr产物要先连在t载体上
11楼：匿名用户
t载体是一种克隆载体，链接后先得到较多的拷贝，可以提高链接表达载体的效率。
重组质粒构建的注意事项？
12楼：匿名用户
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下：
1) 克隆基因的酶切位点问题
2) 载体酶切的问题
3) 连接片段浓度比的问题
在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。在设计pcr引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合dn段上。如ndei就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的hindiii也要三个。
13楼：匿名用户
选择合适的内切酶，作用时间和温度要适宜，连接过程中不要污染，注意片段和质粒的比例
t载体克隆的实验原理
14楼：初晨淡
重组的dna分子是在dna连接酶的作用下，有mg2 、atp存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源dna分子进行连接。
dna连接酶有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。两种dna连接酶都有将两个带有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶还有一种大肠杆菌dna连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链dna分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高t4噬菌体dna连接酶浓度或增加dna浓度来提高平末端的连接效率。 t4噬菌体dna 连接酶催化dna 连接反应分为3 步：首先，t4 dna 连接酶与辅因子atp形成酶-atp复合物；然后，酶-atp复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，使dna腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3’端加上一个突出的碱基a。pucm-t载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的t。这样，pucm-t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到pucm-t载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用x-gal为底物进行染色时，呈蓝色。
一些特定的质粒（比如puc/pbs等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶n端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（mcs）,它并不影响lacz的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶c端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。
只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物iptg的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶n端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶c端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
而当外源基因插入到此种载体质粒lacz的多克隆位点后，会造成lacz基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacz基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物x-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。
古人吃鱼为什么要先吃眼,吃鱼之前为什么先遮住鱼眼？
1楼 西府贾诩 反正我是先吃眼。。。 因为我爱吃。。。 还有就是，一开始不吃的话一会就找不到了。 也有可能是古人认为鱼眼是好东西也说不定。 或者是有一些特殊的含义。比方标识身份尊贵之类的。 个人猜测，不对勿喷。 吃鱼之前为什么先遮住鱼眼？ 2楼 匿名用户 含义，我只知道是酒桌上面的意思，在酒桌上，有...