1楼:匿名用户
菌落baipcr的假阳性很多,也有du很多原因,所以一zhi般都是需要测序结果佐证的。
dao1,引物设计不合适专:选择的扩增属序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行 pcr 扩增时,扩增出的 pcr 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2,靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。
可互相拼接,与引物互补后,可扩增出 pcr 产物,而导致假阳性的产生,可用巢式 pcr 方法来减轻或消除。
质粒连接目的片段,菌液pcr后电泳有目的条带,为什么送菌液测序结果是空载体呢 ?
2楼:exo不偷井盖
1、你bai
的实验目的是什么? 2、如果du是克zhi隆,连接t载体后不用酶dao
切,直接转化菌专落pcr检测有目属
的条带的话送样测序即可。 3、如果是做表达载体构建,pcr产物和质粒dna酶切后与没有酶切的在同一块胶上电泳,如果两个酶切位点很近,几乎看不到被切下来的小片段条带(太小,早就跑出去了)。你要是怕酶切不完全就多稍微加点酶,切的时间长一点。
4、关于酶切产物有几条带视酶切效果而定,酶切完全则两条,一大一小(小的可能看不到,原因见3、)酶切不完全则三条带,一大一小及未切开的pcr产物;质粒的话可能还多一条环状分子和线状分子的区别。
3楼:落叶来也
确定有目的条带么?
如果确定连上了,可能就是挑菌的时候不是单菌落,重新挑,或者原点再取点,涂布或者划线。
菌落pcr会出现假阳性结果吗
4楼:匿名用户
高手们好。最近做酶切连接转化,最后做鉴定时,以菌落为模板进行pcr时可以见到有目的条带;当把菌落接种到lb液扩菌后,以菌液为模板进行pcr时却什么东东都没有?请问会是什么原因啊?
多多指教啊!建议重新以菌落为模板进行pcr检测,再重新以菌液为模板进行pcr检测,因为菌落或者菌液pcr假阳性的几率还是比较高的。但如果还是出现以上结果,推测很可能是平板上残留的连接液中的未连接上载体的目的条带引起的,此时建议再提质粒做pcr检测和酶切检测来彻底证明你的目的片段是否真正与载体连接成功。
个人的见解希望对你有所帮助,也期望高手们批评指正!我觉得菌落pcr效果很好,虽然有假阳性的可能,但是只要是做出来,有目的条带一般是对的,你为什么还要用菌液做pcr?你还不如摇菌后提取质粒然后用质粒pcr或者酶切。
既然你说到这个问题了,我觉得很有可能是你的质粒被稀释了,因为在菌落中的浓度比较大。另外也有可能是你根本就没有挑到正确的菌落来摇菌,所以就没有质粒,怎么能做出来。我觉得你做菌液的pcr和菌液的pcr必须是从单一的一个菌落挑出来的,如果不是,那肯定只有一个是正确的,我做过,只要是同一菌落不会有差错。
你再试试看,祝你成功!谢谢各位高手的及时的回答。现在我都是挑单个菌落后摇菌,然后提取质粒,然后以质粒为模板做pcr,阳性的质粒再酶切进行鉴定,效果还可以。
再次谢谢大家!!!第二次看到这种观点,不确定对不对,借道跟大家讨论一下,不知道lcc有没有文献支持一下这种观点?如果这种观点正确,那我以前很多关于t载体的看法就错了,所以很感兴趣。
我一直以为外面的dn**段会被大肠杆菌分泌出来的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推测很可能是平板上残留的连接液中的未连接上载体的目的条带引起的说来也很奇怪,以前我就是挑菌后加到lb液后摇菌,然后以菌液为模板进行pcr,再以阳性管提取质粒进行酶切鉴定,排除阴性管,这样可以少提一些质粒。
最近菌液pcr总是阴性,所以就直接提质粒进行鉴定了。其中原因真的不知道是什么?我也遇到过,也许是涂抹的转化产物导致的加阳性(菌落pcr)。
各位大大,我倒是碰到过菌液pcr是阴性,但是有质粒的情况,酶切也正确。一般我以为质粒抽屉和酶切鉴定是最保险的。pcr假阳性。
假阴性的概率都很高。菌液的问题在于盐!盐会干扰pcr。
如果用菌液的话,可以用水洗涤离心几次,然后重悬于水,就可以了。 题外话:最近菌落pcr,阴性和阳性对照经常不扩增,而样品扩增,郁闷啊。
5楼:匿名用户
条带两端上扬这种情况在跑电泳很常见,一般把电压调低点跑久点会改善,有时候胶没有做好也会出现这样的情况,注意拔梳子的时候一定要平衡。以前做克隆的时候,阴性对照模板用水扩增也出现过有条带,就像你最后一个泳道。老板说是污染了,把所有的试剂全部换新的,而且加样条件也非常注意,后来就没有条带了。
6楼:匿名用户
菌落pcr的结果参考价值比较下,假阳性太厉害。还是以测序结果为准。可以在测序之前做一下质粒酶切验证