1楼:匿名用户
1、连进去的可能不是你的目标片段,也即酶切产物或者pcr产物本身专就有问题了;
2、污染,属
也就是挑的菌落不纯;
3、在转化的时候有很多的片段其实并未有转入到细胞中,而是在平板上,在做菌落pcr的时候p出的是它们的产物;
4、基因组的影响
其他原因也挺多的
菌落pcr检测有条带,但是测序结果根本没有连上,是什么原因
2楼:匿名用户
菌落baipcr的假阳性很多,也有du很多原因,所以一zhi般都是需要测序结果佐证的。
dao1,引物设计不合适专:选择的扩增属序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行 pcr 扩增时,扩增出的 pcr 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2,靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。
可互相拼接,与引物互补后,可扩增出 pcr 产物,而导致假阳性的产生,可用巢式 pcr 方法来减轻或消除。
单克隆菌落就一定是单基因型吗?
3楼:百浩生物
理论上单克隆bai菌落应该是基因型,du
或者这个菌zhi株有些特别,易突变dao。
还有可能内是这个菌株容一菌株之间有粘连,你划线可能没有得到单克隆。
你可以试一下,取一点菌液,用培养基稀释,吹打,再涂板试一下。尽可能的让菌长得少一些。
做单克隆测序是菌液好还是菌液pcr后测好
4楼:匿名用户
菌液pcr有风险,因为pcr是有一个级联放大的效应在里专面,只要在菌液属中沾了一点转化时用的核酸片段,就有可能会扩增出来。但是送去测序的时候,很可能是假阳性,没有连入任何片段(以前我们就碰到过这种情况,而且还是通过蓝白斑筛选的)。
如果实在没有iptg和x-gal,也最好能先挑几个单菌落去做菌落pcr,从中选取阳性的菌落去做液体摇菌,提质粒,找一个目标判断上有的酶做一个单切,同时用自连的空载作为对照,看是否能够切开。如果菌体克隆切开了,空载切不开,才能说明找到了阳性克隆。送去测序才比较可靠。
否则直接送去测序,很可能全是空载,白白耽误时间。
为了节省时间,也可以先送去测序,等待测序的过程中,进行酶切验证,对了更好,不对赶紧找其他的菌去送样。
我的目的片段**体后,挑单克隆摇菌,用菌液pcr,没有条带。为什么啊?
5楼:阿鲁巴星人
假阳性1.平板是否加抗性?
2.引物设计是否有问题?
3.载体自连现象是不是很严重?建议做个对照4.菌落pcr条件是否合适?
筛选阳性转化子,为什么会出现假阳性现象
6楼:
1.蓝白斑筛选中,白斑是插入外源片段的2.菌落pcr假阳性的产生有很多原因:a引物设计特异性不好b挑取菌落的时候非单克隆c可能沾到未分解的外源片段(菌液pcr要比菌落pcr靠谱一些)
菌落pcr会出现假阳性结果吗
7楼:匿名用户
高手们好。最近做酶切连接转化,最后做鉴定时,以菌落为模板进行pcr时可以见到有目的条带;当把菌落接种到lb液扩菌后,以菌液为模板进行pcr时却什么东东都没有?请问会是什么原因啊?
多多指教啊!建议重新以菌落为模板进行pcr检测,再重新以菌液为模板进行pcr检测,因为菌落或者菌液pcr假阳性的几率还是比较高的。但如果还是出现以上结果,推测很可能是平板上残留的连接液中的未连接上载体的目的条带引起的,此时建议再提质粒做pcr检测和酶切检测来彻底证明你的目的片段是否真正与载体连接成功。
个人的见解希望对你有所帮助,也期望高手们批评指正!我觉得菌落pcr效果很好,虽然有假阳性的可能,但是只要是做出来,有目的条带一般是对的,你为什么还要用菌液做pcr?你还不如摇菌后提取质粒然后用质粒pcr或者酶切。
既然你说到这个问题了,我觉得很有可能是你的质粒被稀释了,因为在菌落中的浓度比较大。另外也有可能是你根本就没有挑到正确的菌落来摇菌,所以就没有质粒,怎么能做出来。我觉得你做菌液的pcr和菌液的pcr必须是从单一的一个菌落挑出来的,如果不是,那肯定只有一个是正确的,我做过,只要是同一菌落不会有差错。
你再试试看,祝你成功!谢谢各位高手的及时的回答。现在我都是挑单个菌落后摇菌,然后提取质粒,然后以质粒为模板做pcr,阳性的质粒再酶切进行鉴定,效果还可以。
再次谢谢大家!!!第二次看到这种观点,不确定对不对,借道跟大家讨论一下,不知道lcc有没有文献支持一下这种观点?如果这种观点正确,那我以前很多关于t载体的看法就错了,所以很感兴趣。
我一直以为外面的dn**段会被大肠杆菌分泌出来的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推测很可能是平板上残留的连接液中的未连接上载体的目的条带引起的说来也很奇怪,以前我就是挑菌后加到lb液后摇菌,然后以菌液为模板进行pcr,再以阳性管提取质粒进行酶切鉴定,排除阴性管,这样可以少提一些质粒。
最近菌液pcr总是阴性,所以就直接提质粒进行鉴定了。其中原因真的不知道是什么?我也遇到过,也许是涂抹的转化产物导致的加阳性(菌落pcr)。
各位大大,我倒是碰到过菌液pcr是阴性,但是有质粒的情况,酶切也正确。一般我以为质粒抽屉和酶切鉴定是最保险的。pcr假阳性。
假阴性的概率都很高。菌液的问题在于盐!盐会干扰pcr。
如果用菌液的话,可以用水洗涤离心几次,然后重悬于水,就可以了。 题外话:最近菌落pcr,阴性和阳性对照经常不扩增,而样品扩增,郁闷啊。
8楼:匿名用户
条带两端上扬这种情况在跑电泳很常见,一般把电压调低点跑久点会改善,有时候胶没有做好也会出现这样的情况,注意拔梳子的时候一定要平衡。以前做克隆的时候,阴性对照模板用水扩增也出现过有条带,就像你最后一个泳道。老板说是污染了,把所有的试剂全部换新的,而且加样条件也非常注意,后来就没有条带了。
9楼:匿名用户
菌落pcr的结果参考价值比较下,假阳性太厉害。还是以测序结果为准。可以在测序之前做一下质粒酶切验证
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