1楼:匿名用户
都适用,建议采用wst(cck8)法,省去了甩板步骤,准确率比mtt高
2楼:
目前做的细胞都适用,最好是贴壁的,不贴壁的话要离心,没有离心培养板的离心机会有点麻烦
3楼:潮秋机代梅
mtt法又称mtt比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。
测定细菌对细胞的毒性试验最好用ldh还是mtt法
4楼:匿名用户
⒈选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行mtt试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。
这样,才能保证mtt结晶形成数量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。
⒉药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。
切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
⒊ 时间点的设定。在不同时间点的测定od值,输入excel表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。
⒋培养时间。200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持68h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向g0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。
⒌mtt法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。做mtt时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致mtt比色od值的升高。
⒍理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
⒎实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、mtt、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、mtt、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。
⒏避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。
因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。 mtt 溶液的配制方法
通常,此法中的mtt 浓度为5mg/ml。因此,可以称取mtt 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(pbs)或无酚红的培养基中,用0.
22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
需要注意的是,mtt法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,mtt 吸光度最好在0-0.7 范围内。
mtt一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把mtt粉分装在ep管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当mtt变为灰绿色时就绝对不能再用了。
mtt有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的mtt需要无菌,mtt对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制mtt时用用pbs溶解,也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶。
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