1楼：匿名用户
（1）挑取大肠杆菌单菌落，接种于5 ml无抗生素的lb液体培养基中，37℃下振荡培养13h，至对数生长后期。将该菌悬液以1:50 的比例接种于100 ml lb 液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至od600＝0.
5。（2）在无菌条件下将培养液转入离心管中，冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃，然后4℃，4000rpm离心10min；
（3）弃去上清，倒置1 min，以便将培养液流尽；
（4）用冰预冷的0.1 mol/l的cacl2溶液10 ml轻轻悬浮细胞，充分混匀，冰上放置30 min后，4℃下4000rpm离心10min；
（5）弃去上清，并倒置1 min，以便最后的痕量培养液流尽；
（6）加入4 ml预冷含15%甘油的0.1 mol/l的cacl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；
（7）感受态细胞100 μl分装，贮存于-70 ℃保存备用。
cacl2法制备大肠杆菌感受态细胞原理？
2楼：匿名用户
原理：转化：将外源dna分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。
受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(r-,m-)，可以容忍外源dna分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法，如电击或cacl2、rbcl/kcl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(***penent cells)，使外源dna分子得以进入。
目前常用的感受态细胞制备方法有cacl2和rbcl/kcl法，rbcl/kcl法制备的感受态细胞转化效率较高，但cacl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此cacl2法为使用更广泛。
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3楼：匿名用户
就是改变了细胞膜的通透性，使细胞膜的选择性吸收发生变化，从而可以吸收外源dna
用氯化钙怎样制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞？
4楼：笔袋dc梞
这属于专业问题啦 下面的简单方案是clhen等(1972)所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒dna产生5x106-2x107 个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案i快速，重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。
1、从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm)，转到一个含有100ml lb或sob培养基的1l烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约3小时(旋转摇床，300转/分)。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞/ml，可每隔 20-30分种测量od600值来监测培养物的生长情况。
在菌株与菌株之间，od600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的od600值，并将各浓度的增减物铺于无抗生素的lb琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。 2、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管(falcon 2070)中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。切记：
下述所有步骤均需无菌操作。 3、于4℃用sorvall gs3转头(或与其相当的转头)以4000转/分离心10分钟，以**细胞。 4、倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
5、以10ml用冰预冷的0.1mol/l cacl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发现将1mol/l cacl2贮存液用纯水(mille-q级或与其相当的级别)配制以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。
制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100ml，用nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌，然后骤冷到0℃即可。对于大多数大肠肝菌菌株(除mc1061外)，在这一步采用tfb代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。
6、于4℃以4000转/分离心10分钟，以**细胞。 7、倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。 8、每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.
1mol/l cacl2[或tfb，见步骤5，注]重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于-70℃冻存。在这些条件下，尽管长期保存后转化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受态。
dagert和ehrlich(1979)曾表明细胞可以于4℃在cacl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加3-5倍，然后降低到初始水平。 9、用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加dna(体积∞10μl，dna∞50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。 10、将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。
11、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。 12、每管加800μl soc培养基。用水溶将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞(转速不超过225转/分)。 13、将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含20mmol/l mgso4和相应抗生素的sob琼脂培养基上。如培养物体积太小(〈10μl)。
可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞，然后用适量soc轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上(或铺在软琼脂中)。
然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物(根据实验决定)铺在单独的平皿上。氨苄青霉素抗性功的增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长掏物质的缘故。 14、将平板置于室温直至液体被吸收。
15、倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺增板时密度较低(每个90mm平板不超过104菌落)，于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化可将β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。
这样，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60μg/ml增至100μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底**之。
如何制备大肠杆菌感受态细胞
5楼：匿名用户
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
准备：一. 材料
e. coli dh5α菌株: rˉ,mˉ,ampˉ；pbs质粒dna: 购买或实验室自制，eppendorf管。
二. 设备
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
三. 试剂
1.lb固体和液体培养基
2.amp母液
3.含amp的lb固体培养基:将配好的lb固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.麦康凯培养基(maconkey agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。
5.0.05mol/l cacl2溶液:称取0.28g cacl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
6.含15%甘油的0.05mol/l cacl2: 称取0.28g cacl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
操作步骤：
一、 受体菌的培养
从lb平板上挑取新活化的e. coli dh5α单菌落,接种于3-5ml lb液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:
100-1:50的比例接种于100ml lb液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至od600 ＝0.5左右。
二、 感受态细胞的制备 ( cacl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
三、 转化
1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、 加入pbs质粒dna溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml lb液体培养基(不含amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替dna溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的lb平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替dna溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的lb平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
四、 计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率**化子数／每mg质粒dna）＝转化子总数／质粒dna加入量(mg)
感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
[注意] 本实验方法也适用于其它e.coli受体菌株的不同的质粒dna的转化。但它们的转化效率并不一定一样。
有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。