1楼：南京金益柏生物科技****
可能是模板浓度太低了，都没有达到阈值的，刚开始要做不同浓度梯度的，摸一下模板浓度条件
2楼：桑桑双子的老巢
你好，扩增曲线可以粗略地判断扩增效率。sybr green的双delta ct法要求目的基因和内参的扩增效率基本一致。如果不一致，需要对公式进行修正，部分qpcr仪的配套软件可以做到，直接输入每对引物的扩增效率。
但无论如何，保证高扩增效率是实验成功的关键。如果扩增效率一致，不同ct的曲线显示出来就基本是平行的位移，其倾斜程度基本一致。而如下图一样，一条比较“陡”，另一条比较“平”，那么意味着扩增效率不一致。
有可能是引物效率不一，或者个别样品、反应孔存在抑制pcr的污染等。
来自：肽度时界威客吴博士，有科研难题、科研需求就上肽度时界吧！
请教下大神，实时定量pcr（qpcr）实验，看扩增曲线的意义是什么？
3楼：科研高手
你好，扩增曲线可以粗略地判断扩增效
率。sybr green的双delta ct法要求目的基因和内参的扩增效率基本一致。如果不一致，需要对公式进行修正，部分qpcr仪的配套软件可以做到，直接输入每对引物的扩增效率。
但无论如何，保证高扩增效率是实验成功的关键。如果扩增效率一致，不同ct的曲线显示出来就基本是平行的位移，其倾斜程度基本一致。而如下图一样，一条比较“陡”，另一条比较“平”，那么意味着扩增效率不一致。
有可能是引物效率不一，或者个别样品、反应孔存在抑制pcr的污染等。
来自：肽度时界威客吴博士，有科研难题、科研需求就上肽度时界吧！
实时定量pcr的结果是怎样分析的
4楼：小乾乾
1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算。
2、一般都是相对量，则用delta delta ct方法来计算。
3、举例如下：对照组基因a的ct值为20， 内参（比如βactin)ct值15。实验组基因a ct值18，内参ct值14。
4、首先算加样量：delta ct=15-14=1。2的1次方是2。
也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。基因a: delta ct=20-18=2。
2的2次方是4。也就是说基因a的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。
5、几点注意：必须确定扩增的特异性，只有相同目标的ct值才能相减（扩增效率有可能不同），2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2，最好不用syber green。
5楼：豆村长de草
实时荧光定量pcr技术是在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
基线在pcr扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光域值threshold的设定，一般将pcr反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是pcr3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在pcr扩增的指数期。
融解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，融解曲线就会出现一尖峰；如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个尖峰。
扩展资料：
时荧光定量pcr仪real-time qpcr 常见问题分析：
1、无ct值出现
1）检测荧光信号的步骤有误：一般sg法采用72℃延伸时采集，taqman法。则一般在退火结束时或延伸结束采集信号；
2）引物或探针降解：可通过page电泳检测其完整性；
3）模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
4）模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2、ct 值出现过晚（ct>38）
1）扩增效率低:反应条件不够优化，设计更好的引物或探针、改用三步法 进行反应、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等；
2）pcr各种反应成分的降解或加样量不足，
3）pcr产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。
3、标准曲线线性关系不佳
1）加样存在误差：使得标准品不呈梯度；
2）标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；
3）引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针；
4）模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
6楼：匿名用户
实时定量pcr的结果是可以和所有核酸结合，没有特异性。
要保证特异性的话，最好用其他的方法。扩增体系中加入模板dna的体积，比如同时10微升的体系，对照组加1微升dna，实验组加2微升dna，则实验组的加样量是对照组的2倍。
看ct值是分析荧光定量pcr最直观的一个数据，ct值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用biodai-pcr荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。
扩展资料：
real-time qpcr 常见问题分析：
一、无ct值出现
1、检测荧光信号的步骤有误：一般sg法采用72℃延伸时采集taqman法。
则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
2、引物或探针降解：可通过page电泳检测其完整性。
3、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
4、模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
二、ct 值出现过晚（ct>38）
1、扩增效率低:反应条件不够优化，设计更好的引物或探针、改用三步法 进行反应、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等。
2、pcr各种反应成分的降解或加样量不足。
3、pcr产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。
三、标准曲线线性关系不佳
1、加样存在误差：使得标准品不呈梯度。
2、标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3、引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。
4、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
四、负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰
1、引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2、引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒。
4、模板有基因组的污染：rna提取过程中避免基因组dna 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
五、扩增效率低
1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
2、反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
3、反应体系中有pcr反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
7楼：寵愛認
常见分析角度：
1.无ct值出现
（1）检测荧光信号的步骤有误：一般sg法采用72℃延伸时采集，taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号；
（2）引物或探针降解：可通过page电泳检测其完整性；
（3）模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
（4）模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2.ct 值出现过晚（ct>38）
（1）扩增效率低:反应条件不够优化，设计更好的引物或探针、改用三步法 进行反应、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等；
（2）pcr各种反应成分的降解或加样量不足，
（3）pcr产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。
3.标准曲线线性关系不佳
（1）加样存在误差：使得标准品不呈梯度；
（2）标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；
（3）引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针；
（4）模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
4.负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰
（1）引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；
（2）引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；
（3）镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix 试剂盒；
（4）模板有基因组的污染：rna提取过程中避免基因组dna 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
5.扩增效率低
（1）反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；
（2）反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法；
（3）反应体系中有pcr反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
8楼：匿名用户
bioghsc super probe kit在20ul的反应体系里，只要有几个拷贝的dna分子就能被检测出来，具有非常强的抗干扰能力，能够对土壤、粪便、肿瘤和血液**的复杂样本中的靶基因进行检测分析，适合探针法定量pcr检测，试剂以预混液的形式包装，使用极其方便。
实时荧光定量pcr的结果该怎样分析？
9楼：群英斗将
1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；
2、一般都是相对量，则用delta delta ct方法来计算；
3、引物或探针降解：可通过page电泳检测其完整性；
4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
5、看ct值是分析荧光定量pcr最直观的一个数据，ct值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用biodai-pcr荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。
扩展资料：
pvr的循环参数：
1、预变性；
模板dna完全变性与pcr酶的完全激活对pcr能否成功至关重要，加热时间参考试剂说明书。
2、变性步骤；
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶dna序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
3、引物退火；
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对pcr的特异性有较大影响。
4、引物延伸；
引物延伸一般在72℃进行（taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
5、循环数；
大多数pcr含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸；
在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。