1楼：匿名用户
一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：
1.二抗应选用与使用的一抗相同的物种**;
2.二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是igg类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗igg抗体;
3.一般来说，不同的种属**与二抗的质量没有必然的联系，**于山羊的二抗与**于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里， 如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊**的，一个是小鼠**的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠**的。
免疫荧光双标两种一抗可以一起加吗
2楼：北京索莱宝科技****
一抗种属不同的情况下，免疫荧光双标两种一抗可以一起加：
容易起交叉反应的是二抗，因为二抗会对igg有反应。而一抗是针对特异蛋白表位的。并不是针对igg的。
免疫荧光实验方法（连续双标法）
石蜡切片
1)烘片
在60℃烘箱放置2-4小时，使蜡流失。
2)脱蜡、脱水
二甲苯溶液中脱蜡，2次，每次5min
100%乙醇，2次，每次3min
95%乙醇，1次，每次3min
90%乙醇，1次，每次3min
85%乙醇，1次，每次3min
h2o，1次，每次3min
3)固定
样本切片在冰的甲醇中放置10min(甲醇溶液在-80℃预冷)
用冰的pbs溶液洗2次，每次3min(pbs溶液在-20℃短暂预冷)
4)透化
用含0.25%tritonx-100的pbs孵育石蜡切片10min(200mlpbs+500ultritonx-100)
用pbs溶液洗3次，每次5min
5)第一荧光标记
用pbst配置1%的bsa封闭液，将切片在封闭液中孵育1h
4℃冰箱，一抗过夜
用枪吸走一抗液体，pbs溶液洗3次，每次5min
二抗室温1h
用枪吸走二抗液体，pbs溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行）
6)第二荧光标记
4℃冰箱，一抗过夜
用枪吸走一抗液体，pbs溶液洗3次，每次5min
二抗室温1h
用枪吸走二抗液体，pbs溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行） 7)dapi对比染色
2g/ml的dapi，15min
用pbs冲洗3次
8)封片
用移液枪吸中性树脂一小滴，盖上盖玻片，用指甲油涂抹边缘，待风干后显微镜照相
免疫荧光，免疫荧光双标，求助
3楼：
免疫荧光法双标法我自己到没做过，不过我一同学在威斯腾生物做过免疫荧光双标
求助免疫荧光双标染色方法
4楼：南京金益柏生物科技****
建议楼主产看文献
http://wenku.baidu.
***/link?url=zf7lnaeihra-1uj00sxtt9ywo1_mvbhkml-t2sfeyq4zojisfkchnn_wtk3cslht0avucljxdbkwk6jg6efkqyb-qpsjbfaiuqi13l-h703 这个文献可以参考下
如何做原位杂交和免疫荧光双标
5楼：匿名用户
呃，实验原理完全不同，但应用上有所交叉，都可以达到检测某段基因在样品中的表达的目的。
楼主你要想彻底理解这个问题，真的必须分别理解这两个不同技术的内涵。老实阅读相关知识吧。这两个东西很少被相提并论，也不是互相可以替代的，单纯谈区别没有意义。
原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的dna或者rna只要他们的序列是互补的，即符合at，cg的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（dna-dna，dna-rna，rna-rna）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的mrna在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内rna进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内dna或rna研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为dna-dna, rna-dna, rna-rna杂交。但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。
求助石蜡切片免疫荧光tunel和neun双标染色
6楼：匿名用户
石蜡切片免疫荧光tunel和neun双标染色曾经作过脑组织的tunel，也指导过别人做心肌的tunel，谈谈我的意见：
蛋白酶k37度30min，好像有点偏长，我是10min。
你是nbt/bicp显色的话，
这说明你用的是ap系统，而不是hrp
这样的话就不是用3%h2o2来去除内源性酶的了，（h2o2是去过氧化氢酶的）；
你现在要去除的是内源性碱性磷酸酶，要用乙酸或左旋咪唑：
我们用的是乙酸，效果很是不错，要不你也试试用乙酸吧，方法：新鲜配置的3%乙酸（ph2.5）孵育（我当时是37℃ 10min）
可以复染：
用核固红（fast red，也有人叫 快红）
免疫荧光单标有意义没有
7楼：南京金益柏生物科技****
有没有意义跟你做荧光还是化学显色没有关系，跟你是做双标还是做单标也没有意义，关键要看你所做的指标能不能说明你想说明的问题，如果单标就能说明问题， 那做双标干什么？
免疫荧光双染，为什么图像形态一模一样
8楼：南京金益柏生物科技****
主要是你检测的目的是不是一致的,如果一个是凋亡的一个是存活的话,那就肯定有问题了.如果你检测的都是存活状态下的,那自然一样了.从**看,的确染色一样.
你可以先关掉红色的激光器（559），单独扫描绿色的，反之扫描红色的，看看**是否和两个激光器同时扫描时想同，如不同则说明你染的**窜色了，这是你双标染色时抗体的浓度，浸染时间等等原因造成的，因为我不知道你的protocol，所以不好说。解决的办法你可以用sequential扫描试试，如不成只能重新做了。做的时候可以先做个预实验，把抗体的浓度降低，用两次单标的方法染色，分别看，再做对照，问题就能解决了。
还有你用共聚焦显微镜扫描的时候或是降低激光输出（laser）值调低或是调节hv和offset的值，把背景去掉，因为你的强度太高了。
我的荧光免疫染色出了什么问题
9楼：匿名用户
你好，细胞生物学产品专家齐氏生物很高兴为您解答，以下是荧光免疫染色常见的5个问题：
1、问:用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同?
参考见解:只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。
2、问:近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项?
参考见解:我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是:
(1)选取一抗时要**于两种不同的动物，我用的是**于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-fitc(绿)和donkey anti-rat-tex-red(红)。
(2)我的做法是两种一抗（chi抗体）同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
(3)我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的igg，荧光标记物对照是pbs+荧光标记物。
(4)封闭血清与二抗**动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
(5)其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
3、问:本人拟做brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为fitc标记，想请教各位大侠:
(1)抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行?
(2)封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/l ph9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片?
(3)免疫酶染色中的3%过氧化氢及2n盐酸是否还需要用?
参考见解:
(1)你的二抗是用fitc标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/l ph9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明;
(3)关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%h2o2以去除内源性过氧化物酶;2n盐酸需要使用，目的是使dna变性，让brdu抗体能够充分地与已经掺入的brdu结合。
4、问:做间接法免疫荧光染色，如何设置对照?
参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。
(1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
(2)阴性对照:标本直接滴加二抗，呈阴性反应。
(3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清，以pbs冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
5、问:我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好:有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢?
参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。
希望能帮您答疑解惑！