1楼：匿名用户
pcr全称多聚酶链式反应，原理是dna的体外扩增。
具体来说：在ep管里加入dna、合成原料（dntp、引物）、耐热的dna聚合酶（taq）后，放入pcr仪，pcr仪会利用升温使dna变性，在聚合酶的作用下使单链复制成双链，进而达到基因复制的目的。
用途：1、核酸的基础研究：基因组克隆
2、不对称pcr制备单链dna用于dna测序3、反向pcr测定未知dna区域
4、反转录pcr（rt-pcr）用于检测细胞中基因表达水平、rna病毒量以及直接克隆特定基因的cdna
5、荧光定量pcr用于对pcr产物实时监控6、cdna末端快速扩增技术
7、检测基因的表达
8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学
2楼：匿名用户
pcr技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品dna，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买pcr检测试剂盒就可开展工作，pcr自动热循环中影响因素很多，对不同的dna样品，pcr反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数
在pcr自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。
在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。
关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。
1．模板变性温度变性温度是决定pcr反应中双链dna解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链dna模板，pcr也就不会启动。变性温度低则变性不完全，dna双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。
样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。dna变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持taq dna聚合酶的活力，加入taq dna聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。
2．引物退火温度退火温度决定pcr特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，dna扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（g+c）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度ttm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算：
ta = tm - 5℃= 4(g+c)+ 2(a+t) -5℃
其中a，t，g，c分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（g+c）%含量为50%时，则ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时（如0.
2μmol/l）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。
3．引物延伸温度温度的选择取决于taq dna聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、ph值、盐浓度与dna模板的性质。
扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因taq dna聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。
对于1kb以上的dn**段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min，与此同时，在pcr缓冲液中需加入明胶或bsa试剂，使taq dna聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长dn**段。
4．循环次数常规pcr一般为25～40个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。
所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。
扩增结束后，样品冷却并置4℃保存。
二、引物引物设计
要扩增模板dna，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶dna序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此可见，引物是决定pcr扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。
引物设计的必要条件是与引物互补的靶dna序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为15～20个碱基，可以用dna合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此之外，引物设计一般遵循的原则包括：
1．引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72℃）下不会形成稳定的杂合体。
有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。
有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。
2．（g+c）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（g+c）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（g+c）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳。
3．引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。例如：
4．引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（primer dimer）。所谓引物二聚体实质上是在dna聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链dn**段，是pcr常见的副产品，有时甚至成为主要产物。
另外，两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶dna或样品dna的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。
5．引物3’端配对dna聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以，引物3’端5～6个碱基与靶dna的配对要求必须精确和严格，这样才能保证pcr有效扩增。
引物设计是否合理可用pcrdesn软件和美国primer软件进行计算机检索来核定。
人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱（层析）纯化或page纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。纯化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的引物应保存在-20℃冰箱中，在液体中引物能保存6个月，冻干后可保存1～2年。
3楼：匿名用户
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，简称pcr，是一种分子生物学技术，用于放大特定的dn**段。可看作生物体外的特殊dna复制。
dna聚合酶（dna polymerase i）最早于1955年发现 ，而较具有实验价值及实用性的klenow fragment of e. coli 则是于70年代的初期由dr. h.
klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌（thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
pcr最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 dr. kjell kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似pcr前两个周期反应）的实验。
而现今所发展出来的pcr则于1983由 dr. kary b. mullis发展出的，dr.
mullis当年服务于pe公司，因此pe公司在pcr界有着特殊的地位。dr. mullis 并于1985年与 saiki 等人正式表了第一篇相关的**。
此后，pcr的运用一日千里，相关的**发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后pcr技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
［pcr原理］
[编辑本段]
dna的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链dna在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在dna聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，dna在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制dna的变性和复性，并设计引物做启动子，加入dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的体外复制。
但是，dna聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的dna聚合酶，不仅操作烦琐，而且**昂贵，制约了pcr技术的应用和发展。
发现耐热dna聚合同酶--taq酶对于pcr的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使pcr技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，pcr技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
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