1楼:匿名用户
我们就用baisds加样
缓冲液(不含酚红和du巯基乙醇)裂解细
zhi胞 ,效果还可以dao.
1.pbs洗三遍,吸出全部pbs.
2.60mm培养皿加内50ulsds裂解缓冲液容,冰上孵育10分钟.
3.细胞刮刀刮,转移到eppendorf管中.
4.煮沸10分钟
5.离心10分钟12000g
6.取上清.
如何从细胞中提取蛋白质
2楼:句月听风
(一)水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解.提取的温度要视有效成份性质而定.一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间.
但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作.为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等).
下面着重讨论提取液的ph值和盐浓度的选择.
1、ph值蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的ph值应选择在偏离等电点两侧的ph 范围内.用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液.
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用.同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量nacl等中性盐,一般以0.15摩尔.
升浓度为宜.缓冲液常采用0.02-0.
05m磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液.
(二)有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必须在低温下操作.丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内(度为10%,40度为6.
6%)不会引起酶的变性失活.
求助:怎么提取细胞上清液中的蛋白
3楼:匿名用户
怎么提取细胞上清液中的蛋白 western blot中蛋白样品调节浓度有很多方法 先检测出各
个蛋白样品的浓度,根据体积通过不同单位的loading buffer将样品稀释成不同的体积,即可以保证各个蛋白样品浓度一致 或者在样品裂解的时候,用裂解液或者pbs去稀释蛋白样品,达到调节浓度的。细胞比较简单,只有细胞膜,抽提过程中,很容易破坏细胞膜,从而得到蛋白,相应蛋白中受到其他物质干扰也比较少,样品较为干净。但是用组织的时候,组织由细胞组成,但是从组织中抽提丹巴就要复杂,做组织匀浆以后,再分离组织碎片和蛋白,但是分离过程可能没有那么好,组织中含有的各种杂质,杂蛋白就比细胞中要多,要复杂。
因此选择适当的方法提取组织蛋白,对于后续的western来说还是非常重要的,这也是为什么细胞的蛋白做wb挺好,但是换到组织,可能有些条件就需要进一步优化了。
4楼:秋雨梧桐叶落石
要看你细胞培养上清也中的蛋白是否带有his标签,或者具有金属离子结合作用了。
怎么从悬浮细胞中提取蛋白做wb
5楼:匿名用户
细胞比较简单,只有细胞膜,抽提过程中,很容易破坏细胞膜,从而得到蛋白,相应蛋白中受到其他物质干扰也比较少,样品较为干净。
但是用组织的时候,组织由细胞组成,但是从组织中抽提丹巴就要复杂,做组织匀浆以后,再分离组织碎片和蛋白,但是分离过程可能没有那么好,组织中含有的各种杂质,杂蛋白就比细胞中要多,要复杂。因此选择适当的方法提取组织蛋白,对于后续的western来说还是非常重要的,这也是为什么细胞的蛋白做wb挺好,但是换到组织,可能有些条件就需要进一步优化了。
如何检测一个细胞中的蛋白质表达量
6楼:北京索莱宝科技****
实时荧bai光定量pcr检测mrna的表达du,然后westernblot检测蛋白表达量zhi.
首先你确dao定拿到了这版两种细胞系,通过pcr反应权证明一个是野生型一个是突变型,即snp。然后用试剂盒提取rna,设计引物,采用半定量或绝对定量的方法,测定mrna表达水平;然后另取细胞裂解,提取总蛋白,用特异性抗体检测蛋白表达量。
如何提取细胞上清中的有意义蛋白
7楼:文帝宝宝
做细胞培液上清中的蛋白,应该用无血清培液。光牛血清中的蛋白就够你分析的了,更何况多数分泌蛋白的量都是含量很少的。
怎样提取细胞质或细胞核中的蛋白,细胞核内蛋白和细胞浆蛋白提取有什么区别
1楼 匿名用户 细胞比较简单，只有细胞膜，抽提过程中，很容易破坏细胞膜，从而得到蛋白，相应蛋白中受到其他物质干扰也比较少，样品较为干净。 但是用组织的时候，组织由细胞组成，但是从组织中抽提丹巴就要复杂，做组织匀浆以后，再分离组织碎片和蛋白，但是分离过程可能没有那么好，组织中含有的各种杂质，杂蛋白就比...