1楼：匿名用户
淀粉酶活力的测定
一、目的
学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。
二、原理
淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。
α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在ph3.6以下迅速钝化。
β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。
在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
萌发的小麦种子（芽长约1cm）
2．仪器
（1）离心机
（2）离心管
（3）研钵
（4）电炉
（5）容量瓶：50ml×1, 100ml×1
（6）恒温水浴
（7）20ml具塞刻度试管×13
（8）试管架
（9）刻度吸管：2ml×3, 1ml×2, 10ml×1
（10）分光光度计
3．试剂（均为分析纯）
（1）标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20ml 2mol/l naoh溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使co2进入。
若溶液混浊可过滤后使用。
（3）0.1mol/l ph5.6的柠檬酸缓冲液
a液：（0.1mol/l 柠檬酸）：称取c6h8o7·h2o 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1l。
b液：（0.1mol/l柠檬酸钠）：称取na3c6h5o7·2h2o 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1l。
取a液55ml与b液145ml混匀，既为0.1mol/lph5.6的柠檬酸缓冲液。
（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l ph5.6的柠檬酸缓冲液中。
四、操作步骤
1．麦芽糖标准曲线的制作
取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：
表1 麦芽糖标准曲线制作
试 剂
管 号12
3456
7麦芽糖标准液（ml）
00.2
0.61.0
1.41.8
2.0蒸馏水（ml）
2.01.8
1.41.0
0.60.2
0麦芽糖含量（mg）
00.2
0.61.0
1.41.8
2.03,5-二硝基水杨酸（ml）
2.02.0
2.02.0
2.02.0
2.0摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。
以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
2．淀粉酶液的制备
称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。
然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。
吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。
2． 酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。
表2 酶活力测定取样表
操 作 项 目 α淀粉酶活力测定 β-淀粉酶活力测定
ⅰ- 1 ⅰ- 2 ⅰ- 3 ⅱ- 4 ⅱ- 5 ⅱ- 6
淀粉酶原液（ml） 1.0 1.0 1.0 0 0 0
钝化β-淀粉酶 置70℃水浴15min，冷却
淀粉酶稀释液（ml） 0 0 0 1.0 1.0 1.0
3,5-二硝基水杨酸（ml） 2.0 0 0 2.0 0. 0
预保温 将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min
1%淀粉溶液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min
3,5-二硝基水杨酸（ml） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0
将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。
五、结果计算
计算ⅰ- 2、ⅰ- 3光密度平均值与ⅰ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算α- 淀粉酶的活力。
计算ⅱ- 2、ⅱ- 3光密度平均值与ⅱ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力。
β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力
六、附 注
（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。
（2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃。
（3）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。
推荐**：
http://****estarch.***/news/26/news_6498.html
http://****bbioo.***/bio101/2006/7201.htm
http://****scuta.edu.**/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy18.htm
在测定酶活力时,为什么对试剂配置、实际用量、血清用量、温度、ph、作用时间均需严格控制? 5
2楼：匿名用户
谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定
几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。
α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1，4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原性糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1，4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。本实验以萌发种子为材料，测定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差异。
【原理】
两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在ph3
在测定酶活力时,为什么对试剂配置、实际用量、血清用量、温度、ph、作用时间均需严格控制?
3楼：匿名用户
法1：称取硫酸铜（cuso4.5h2o）34.
7g溶于500ml蒸馏水中。静置一天后过滤。b ：
称取酒石酸钠钾173g加氢氧化钠50g共同溶于蒸馏水并稀释至500ml,静置二天后过滤
法2：1)取硫酸铜结晶 6.93 g.加水使溶解成 100 ml.
(2)取酒石酸钾钠结晶 34.6 g 与 氢氧化钠 10 g.加水使溶解成 100 ml.
法3：称取无水na2co340g，溶于100ml蒸馏水中,溶后加酒石酸7.5g若不易溶解可稍加热，冷却后移入1000ml的容量瓶中。
另取纯结晶cuso4 4.5g溶200ml蒸馏水中，溶后再将此溶液倾入上述容量瓶内，加蒸馏水至1000ml刻度，放置备用。
法3最好。
碱性铜试剂是测量微量还原性糖的重要方法。
淀粉酶活力测定实验中，为什么总是要强调准确反映一定时间？
4楼：匿名用户
酶活力是反应速率
，如果时间不准的话，速率当然不准了，如果因为计算时实验不准而得到低速率，产品方生产时如果参考你的文献时就不会使用这种产品了。它的前途也会受到影响，如果被证实你的数据有问题的话，甚至有可能说你的**是虚造的......问题很严重
加入缓冲液是因为在水解后溶液体积会变化，而缓冲液的ph相对于单一物质来说更稳定些，酶活变化不大，可以忽略。
5楼：鱼骨头
准确时间是和酶活定义相关的，单位时间内催化反应的量，ph5.6缓冲液，40度是酶的最适ph和反应温度
6楼：造纸化学品
不准确的反应时间，肯定会影响的你的结果啊。
酶的活性对ph、温度、浓度都会比较敏感
7楼：丫丫浩儿
做一下试验不就知道了吗？时间不准确会影响酶活力，酶活力的检测最重要就是时间、温度、ph。
在测定酶活力时应注意哪些反应条件?为什么?
8楼：盖盖好胸
温度，酸碱性，酶浓度，这些都是影响酶活性的主要因素
9楼：匿名用户
底物浓度；酶浓度；温度；离子强度和ph值；辅助因子；激活剂；抑制剂