1楼：匿名用户
这个要看细胞的状态和蛋白表达特点。推荐了解“主细胞库”“工作细胞库”这两个名词。
如何利用慢病毒载体构建稳定表达外源基因的细胞系不
2楼：匿名用户
真核表达载体包括腺病毒载体和慢病毒载体，在真核细胞内用于表达目的蛋白的载体都可以叫做真核载体。 腺病毒载体携带外源基因较大，可瞬时高表达。 慢病毒载体携带外源基因较小些，但可以重组入细胞基因组，稳定高表达。
1.将外源基因插入慢病毒载体
2.将构建完成的载体与慢病毒包装质粒混合，共转染靶细胞3.收集病毒液
4.用病毒液感染靶细胞
5.用载体上带的抗生素进行筛选，如果没有，可以用无限稀释法6.获得稳转株
如何构建稳定细胞株？
3楼：心無所依
构建方法：先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒dna中的抗性标志来筛选该细胞系，就行成了稳定表达的细胞株。
细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(continuous cell line)， 培养50代以上并无限培养下去。
细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。
4楼：匿名用户
一种是脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。另外一种是应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。
脂质体转染：在转染24小时后，消化细胞并计数。将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。
待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。筛选时间和浓度视细胞而定。一般g418一个星期作用，嘌呤霉素2-3天。
脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。
病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。
包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。
病毒转染得到稳定细胞株的效率高，只是步骤繁琐。
现在很多家公司提供构建稳定细胞株的技术服务，如杭州的波因、南京的凯基等，可以提供各种载体的构建及细胞株的构建整套技术服务。
如何利用慢病毒载体构建稳定表达外源基因的细胞系
5楼：阿鲁巴星人
1.将外源基因插入慢病毒载体
2.将构建完成的载体与慢病毒包装质粒混合，共转染靶细胞3.收集病毒液
4.用病毒液感染靶细胞
5.用载体上带的抗生素进行筛选，如果没有，可以用无限稀释法6.获得稳转株
具体可以参考该文献：《c-met基因sirna慢病毒表达载体的构建及其稳定转染细胞》
转染后，荧光消失快，g418不能维持荧光表达，怎么筛选稳定细胞系
6楼：蒾藥
瞬时转染是指外源基因
进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在外源基因导入细胞24～96h内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。超螺旋质粒转染更倾向于瞬时表达。
对于瞬时转染的检测：如果有报告基因，就通过报告基因的表达看转染成功与否；没有报告基因的话，就在24～96h内收获细胞通过rt-pcr和wb来鉴定。
pcdna3.1重组质粒用脂质体转染原代培养细胞能稳定表达吗
7楼：北京索莱宝科技****
真核表达载体pcdna3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在cos-7细胞中瞬时表达
【摘 要】 目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme,bace）基因的真核表达载体,为修复阿尔茨海默病(alzheimer's disease,ad)损伤神经元奠定基础.方法 采用rt-pcr方法,从人的成神经细胞瘤的总cdna中,扩增出1.5kb的bace cdn**段,再用bamhi和xhoi双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcdna3.
1中,用限制性内切酶酶切分析和dna序列分析鉴定重组质粒；以免疫细胞化学法检测bace基因的表达情况.结果 人bace基因的cdna已克隆到真核细胞表达载体pcdna3.1质粒中；经脂质体转染cos-7细胞后,并由潮霉素进行筛选,可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的bace蛋白表达.
结论 成功构建了pcdna3.1-bace的真核表达载体,为研究bace基因在ad发病机制中的作用及抑制bace,为**ad奠定一定的实验基础.
293t细胞为什么经常用于转染、蛋白质表达？
8楼：风翼残念
许多真核表达载体如pcdna3.1中含有sv40病毒的复制起始位点，可以在表达sv40病毒t抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。293t细胞就是一种表达sv40病毒t抗原的细胞系，它**于人胚胎肾细胞293hek。
经改造后在其中插入了t抗原，因此用293t细胞做转染可以获得较高的表达水平。 293t细胞也可以作为普通的哺乳细胞用于筛选稳定表达的细胞系，不过它贴壁性差，容易脱落，不利于筛选。 3t3细胞是小鼠胚胎成纤维细胞系，它具有明显的接触抑制作用，所以易于识别已发生转化的细胞。
293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如hek293，293t/17等，**都是人胚胎肾细胞，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
293t细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒e1a基因的转染，能表达sv40大t抗原，含有sv40复制起始点与启动子区。
一个质粒转染后为什么表达两条蛋白带
9楼：匿名用户
转染(transfection)：指真核细胞由于外源dna掺入而获得新的遗传标志的过程.常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类.
转染目的：研究你的目的片段到细胞内的表达.
转染一般是将目的基因构建到某个载体,将构建好的重组质粒导入细胞中,这样就能表达你所要的目的蛋白用于后续实验.需要根据具体情况进行具体分析，推荐从以下角度进行分析： 对细胞表达目的蛋白的时间进行梯度设计，分别取样然后做sds-page\wb分析； 参考实验室经验数据； 尝试采用磁珠ip试剂盒产品（义翘有相关产品）进行小量样品的快速纯化；