1楼：匿名用户
细胞增殖的检验方法：brdu标记法
1、细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4％fcs培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于g0 期。
2、终止细胞培养前，加入brdu（终浓度为30μg/l），37℃，孵育40min。
3、弃培养液，玻片用pbs洗涤3次。
4、甲醇/醋酸固定10min。
5、经固定的玻片空气干燥，0.3％h2 o2 -甲醇30min灭活内源性氧化酶。
6、5％正常兔血清封闭。
7、甲酰胺100℃，5min变性核酸。
8、冰浴冷却后pbs洗涤，加1抗即抗小鼠brdu单抗（工作浓度1：50），阴性对照加pbs或血清。
9、按abc法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及brdu阳性细胞数，计算标记指数（li）。
检测细胞增殖的方法有哪些
2楼：
目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行**的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。
显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。
用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测dna链中氚含量。若细胞具有增殖能力，dna合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞dna链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行dna的合成。
但更为常用的方法是brdu检测法。用brdu预处理的细胞中，brdu可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的dna双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测dna中brdu的含量（如采用鼠抗brdu单克隆抗体特异识别brdu,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠igg二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。
calbiochem/emd公司提供一种brdu检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。
1000个细胞以上水平的检测只需用brdu预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。
brdu法的一个缺点是需要固定和变性等破坏dna的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总dna含量，然而，在变性条件下，dna的双链结构将被破坏，dapi和hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别dna，因而也无法估计dna总量。molecular probes公司的click-it edu(5－乙炔－2'－脱氧尿嘧啶)检测试剂盒可以解决这个问题。
这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性dna双链中的edu分子。
采用brdu方法时，你必须非常小心的去对dna进行变性，才能一方面使brdu抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链dna分子来进行细胞周期的分析。有了edu后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于dna变性的hcl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了brdu检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在edu法中不存在。
图1：edu及brdu原理示意图（摘至invitrogen说明书）
在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，alamar blue，mtt及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。
calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一种四唑盐试剂wst-1来对细胞活力进行快速的检测。线粒体剪切wst－1试剂，产生一种水溶性的formazan盐，所以这是一种相对可靠的测定健康细胞活力的方法。一种类似的但更为灵敏的方法是calbiochem公司的超敏细胞增殖试剂盒，采用calcein-am（一种荧光探针）来标记细胞。
这种增加的灵敏度来自于额外的检测步骤，即采用pbs替代培养基或血清来减小背景。
invitrogen公司还提供了一种采用荧光素酶检测细胞内atp水平的方法。健康细胞中荧光素激发出的光可以很容易读出，并且具有非常小的背景。无荧光信号表明细胞线粒体不在产生atp。
因此，这些方法当然也可用于细胞毒性检测实验。
细胞增殖检测方法：总论
一、胸腺嘧啶核苷（3h-tdr）渗入法
胸腺嘧啶核苷（tdr）是dna特有的碱基，也是dna合成的必需物质。用同位素3h标记tdr即3h-tdr作为dna合成的前体能掺入dan合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞dan的代谢及细胞增殖情况。但是具有放射性。
二、mtt检测法
mtt检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法，其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的mtt分解成兰紫色的甲（formazan），生成的甲量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比
三、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（cfse）检测法
羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（cfse）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使c e成为一种良好的细胞标记物。cfse进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞**时，cfse标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
四、brdu检测法
brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在dna合成期（s期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗brdu单克隆抗体，icc染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
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一、mtt比色：
mtt比色是一种
目前被广泛采用的检测细胞生长和存活的方法，其原理是外源性mtt（四唑盐）可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成难溶的蓝紫色结晶物并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能，dmso（二甲基亚砜）能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联检测仪在490nm波长处检测其光密度值，可间接反映活细胞数量。在一定范围内，mtt结晶物形成的量与细胞数成正比，此方法已广泛用于检测细胞活力、观察细胞生长等方面，具有灵敏度高、重复性好、操作简便、经济、快速、易自动化、无放射性污染等特点，与细胞计数有良好的相关性。
二、rdu标记法
1．细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4％ fcs培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于g0期。
2．终止细胞培养前，加入brdu（终浓度为30μg/l），37℃，孵育40min。
3．弃培养液，玻片用pbs洗涤3次。
4．甲醇/醋酸固定10min。
5．经固定的玻片空气干燥，0.3％h2o2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。
6．5％正常兔血清封闭。
7．甲酰胺100℃，5min变性核酸。
8．冰浴冷却后pbs洗涤，加1抗即抗小鼠brdu单抗（工作浓度1：50），阴性对照加pbs或血清。
9．按abc法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及brdu阳性细胞数，计算标记指数（li）。
三、结晶紫法
1．体外细胞培养结束后，去培养液，加入11％的戊二醛固定，置于振荡器上摇20min。
2．固定细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净。
3．置空气或烘箱37℃彻底干燥。
4．加入0.1％的结晶紫液对细胞染色，振摇30min。
5．用蒸馏水洗涤，至多余的结晶紫液冲洗干净。
6．置空气或37℃烘箱中彻底干燥。
7．加入10％的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取。
8．1h后在酶标仪上测定光吸收度，波长595nm。
四、酸性磷酸酶法
1．96孔细胞培养板中培养细胞，去培养液。用0.01mol/l pbs洗涤1次（如为悬浮细胞则用离心洗涤）。
2．去洗涤液后加入磷酸酶底物100μl/孔。
3．37℃，孵育1～4h。
4．加入0.1mol/l氢氧化钠10μl/孔。
5．在多孔酶标仪上405nm处测光吸收度，将细胞培养板其中不含细胞，同样处理过的一孔作为空白对照，所测的每孔光吸收度可间接反应每孔中的细胞数。如在同样条件下作一细胞数的系列标准对照，以细胞数为x轴，光吸收度为y轴，可作直线回归，可推算出每孔中的细胞。
检测细胞增殖常用的方法有哪些谢谢（细胞
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一、mtt比色：
mtt比色是一种目前被广泛采用的检测细胞生长和存活的方法，其原理是外源性mtt（四唑盐）可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成难溶的蓝紫色结晶物并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能，dmso（二甲基亚砜）能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联检测仪在490nm波长处检测其光密度值，可间接反映活细胞数量。在一定范围内，mtt结晶物形成的量与细胞数成正比，此方法已广泛用于检测细胞活力、观察细胞生长等方面，具有灵敏度高、重复性好、操作简便、经济、快速、易自动化、无放射性污染等特点，与细胞计数有良好的相关性。
二、rdu标记法
1．细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4％ fcs培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于g0期。
2．终止细胞培养前，加入brdu（终浓度为30μg/l），37℃，孵育40min。
3．弃培养液，玻片用pbs洗涤3次。
4．甲醇/醋酸固定10min。
5．经固定的玻片空气干燥，0.3％h2o2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。
6．5％正常兔血清封闭。
7．甲酰胺100℃，5min变性核酸。
8．冰浴冷却后pbs洗涤，加1抗即抗小鼠brdu单抗（工作浓度1：50），阴性对照加pbs或血清。
9．按abc法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及brdu阳性细胞数，计算标记指数（li）。
三、结晶紫法
1．体外细胞培养结束后，去培养液，加入11％的戊二醛固定，置于振荡器上摇20min。
2．固定细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净。
3．置空气或烘箱37℃彻底干燥。
4．加入0.1％的结晶紫液对细胞染色，振摇30min。
5．用蒸馏水洗涤，至多余的结晶紫液冲洗干净。
6．置空气或37℃烘箱中彻底干燥。
7．加入10％的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取。
8．1h后在酶标仪上测定光吸收度，波长595nm。
四、酸性磷酸酶法
1．96孔细胞培养板中培养细胞，去培养液。用0.01mol/l pbs洗涤1次（如为悬浮细胞则用离心洗涤）。
2．去洗涤液后加入磷酸酶底物100μl/孔。
3．37℃，孵育1～4h。
4．加入0.1mol/l氢氧化钠10μl/孔。
5．在多孔酶标仪上405nm处测光吸收度，将细胞培养板其中不含细胞，同样处理过的一孔作为空白对照，所测的每孔光吸收度可间接反应每孔中的细胞数。如在同样条件下作一细胞数的系列标准对照，以细胞数为x轴，光吸收度为y轴，可作直线回归，可推算出每孔中的细胞。